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免疫组化常见问题及分析

 IHC 实验常见问题

 

1、染色过强

原因:抗体浓度过高或孵育时间过长
解决办法:降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1 小时或4 度过夜
原因:孵育温度过高超过37 度
解决办法:一般在室温20-28 度
原因:DAB 显色时间过长或浓度过高
解决办法:显色时间不超过5-12 分钟,以显微镜下观察为准
 

2、非特异性背景染色

原因:操作过程中冲洗不充分
解决办法:每步冲洗3 次每次5 分钟
原因:组织中含过氧化物酶未阻断
解决办法:可再配置新鲜3%H2O2 封闭孵育时间延长
原因:组织中含内原性生物素
解决办法:正常非免疫动物血清再封闭
原因:血清蛋白封闭不充分
 
3、染色弱
原因:抗体浓度过低、孵育时间过短
解决办法:提高抗体浓度、孵育时间不能少于60 分钟
原因:操作中添加试剂时缓冲液未沥干
解决办法:每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 (应防止切片干燥)
原因:室温太低,低于15 度
解决办法:要改放在37 度孵育箱孵育30-60 分钟或4 度冰箱过夜
原因:蛋白封闭过度
解决办法:封闭不要超过12 分钟
 
4、染色阴性
原因:操作步骤错误
解决办法:应重试,设阳性对照
原因:组织中无抗原
解决办法:设阳性对照以验证试验结果
原因:一抗与二抗种属连接错误
解决办法:仔细确定一抗二抗种属无误

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