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免疫组化操作流程

 免疫组化操作流程

 

(一) 仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅
 
(二) 试 剂
1. PBS缓冲液(ph7.2―7.4):NaC137mmol/L,KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L.
2.0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3.0.5mol/L EDTA缓冲液(ph8.0):700ml水中溶解186.1g EDTA&
8226;2H2O,用10mmol/L
NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS缓冲液(ph8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至ph8.0,加水1000ml。
5. 酶消化液:a. 0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(ph9.0–9.5)等量混合
b 油和TBS(PBS)配制
8.TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本
 
(三) 操作流程
1 脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2 抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
A 抗原热修复
a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。
C 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟,反复1-2次。适用的抗原:
Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.
ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP.
Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
 
3 免疫组化染色
 
SP法
(1) 脱蜡、水化
(2)PBS洗2-3次各5分钟
(3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟
(4)PBS洗2-3次各5分钟
(5)抗原修复
(6)PBS洗2-3次各5分钟
(7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
(8)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
(9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟
(10)PBS洗3次每次2分钟
(11)滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时
(12)Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.
(13)PBS洗3次各5分钟
(14)DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度
(15)PBS或自来水冲洗10分钟
(16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化
(17)自来水冲洗10-15分钟
(18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
(1) 脱蜡、水化
(2)PBS洗2次各5分钟
(3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次
(4)抗原修复
(5) PBS洗5分钟
(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
(7)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
(8)PBS洗3次各2分钟
(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分钟
(10)PBS洗3次各2分钟
(11)滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
(12) PBS洗4次各5分钟
(13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色
(14)脱水、透明、封片、镜检。

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